PCR 电泳鉴定实验技术介绍

PCR 电泳鉴定实验技术介绍

一、技术概述

PCR电泳鉴定是一种基于聚合酶链式反应（PCR）扩增目标DNA片段，结合琼脂糖凝胶电泳分离技术的分子生物学方法。通过特异性引物扩增目标序列后，利用电泳分离不同大小的DNA片段，借助核酸染料（如GelRed）显色，直观判断扩增产物是否符合预期，广泛应用于基因分型、克隆验证、突变检测及病原体核酸筛查等领域

二、实验目的

本实验通过PCR扩增目标DNA区域，结合琼脂糖凝胶电泳分析验证扩增产物的大小及特异性，从而定性或定量检测样品中目标核酸的存在。

三、实验流程

1、DNA抽提

取样品至冷冻研钵中，加入液氮研磨至粉末状，转移至1.5mL离心管中，振荡混匀之后，严格按照“TIANamp Genomic DNA Kit”试剂盒说明书步骤进行提取。

2、PCR扩增

1）将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2）冰上配制下表中的反应液

成分 加入量 终浓度

PrimeSTAR Max Premix（

2X） 15μL 1×

Forward Primer (10μM) 0.6μL 0.2 μM

Reverse Primer (10μM) 0.6μL 0.2 μM

DNA 100 ng

RNase-free Water To30μL

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

循环数 步骤 温度 时间

40 预变性 98℃ 10s

变性 55℃ 5s

退火 72℃ 5s

四、技术优势

✅ 高特异性：基于引物设计的靶向扩增，避免非特异产物干扰

✅ 快速直观：2小时内完成扩增与电泳，条带大小直接反映结果

✅ 灵活性强：可适配不同样本类型（基因组DNA、质粒、PCR产物）；

四、适用范围

1️⃣ 分子克隆中插入片段的验证（如载体构建、重组质粒筛选）

2️⃣ 病原微生物的快速检测（如HPV分型、乙肝病毒DNA筛查）

3️⃣ 转基因生物（GMO）中外源基因的鉴定

4️⃣ 科研实验中基因表达调控元件的功能验证；

五、代表性实验结果

特定病原定性检测结果: A.primer 序列  B.琼脂糖凝胶电泳图

七、提供

1 细胞样品: ＞2×107；细胞培养上清≥1ml

动植物组织/细菌、真菌样品: ＞100mg（黄豆粒大小）；

血清、血浆、全血及其他体液样品: ＞200μl；

2 提供目标序列引物信息或所需检测的基因名称

（注：避免样本反复冻融，DNA降解可能导致假阴性；液体DNA样本建议干冰运输）