乙肝疫苗联合含CpG基序寡脱氧核苷酸和卡介苗对小鼠的

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• 基础研究 BASIC RESEARCH •

乙肝疫苗联合含CpG基序寡脱氧核苷酸和卡介苗对小鼠的

免疫应答影响

王 甦, 陈 群, 王 兴, 张 燕, 马 丽, 汪中强

王甦，王兴，张燕，扬州大学医学院附属医院传染科 江苏省扬州市

225001陈群， 扬州大学医学院形态学教研室 江苏省扬州市 225001

马丽，汪中强，扬州大学医学院附院血液科 江苏省扬州市 225001

王甦，男，1965-02-05生，泰州市姜堰市人，汉族，2003年四川大学华西临床医学院医学博士，副主任医师，主要从事病毒性肝 炎的研究.

扬州大学自然科学资金资助项目江苏省扬州市卫生局资助项目，No. K0111237

通讯作者：陈群，225001，江苏省扬州市淮海路11号，扬州大学医学院形态学教研室.

收稿日期：2005-05-28    接受日期：2005-06-13

Effect of hepatitis B vaccine with

CpG oligodeoxynucleotide or

Bacilli Calmette Guerin on immune

responses in mice

Su  Wang,  Qun  Chen,  Xing  Wang,  Yan  Zhang,  Li  Ma,

Zhong-Qiang Wang

Su  Wang,  Xing    Wang,  Yan  Zhang, Department  of  Infection  Dis-

eases  of  Medical  Collage,  Yangzhou  University,  Yangzhou  225001,

Jiangsu Province, China

Qun Chen, Department of Morphology of Medical Collage, Yangzhou

University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China

Li Ma, Zhong-Qiang Wang, Department of Blood Disease of Medical

Collage,  Yangzhou  University,  Yangzhou  225001,  Jiangsu  Province,

China

Supported by the Natural Science Foundation of Yangzhou University,

and  the  Fund  from  Health Administration  of Yangzhou,  Jiangsu  Prov-

ince, No. K0111237

Correspondence to: Qun Chen, Department of Morphology of Medi-

cal Collage, Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province,

China

Received: 2005-05-28    Accepted: 2005-06-13

Abstract

AIM:  To  investigate  the  effects  of  hepatitis  B  vaccine

with  CpG  oligodeoxynucleotide  (ODN)  or  Bacilli

Calmette Guerin on the immune responses in mice.

METHODS: BALB/c  mice  were  subcutaneously

injected with different doses of hepatitis B vaccine (0.25,

0.75, 1.0 μg) combined with CpG ODN or BCG. The

levels  of  serum  hepatitis  surface  antibody  (anti-HBs)

were  detected  by  ELISA  assays  two  and  four  weeks

after  injection.  The  changes  of  peripheral  blood  T

lymphocyte  subsets  CD4+,  CD8+  and  CD4+/CD8+  ratio

were detected by flow cytometry.

RESULTS: Four  weeks  after  injection,  the  levels

of  serum  anti-HBs  in  the  mice  injected  with  the

combination of CpG ODN and hepatitis B vaccine (0.75

and 1.0 μg, respectively) were significantly higher than

that with CpG ODN and 0.25 μg hepatitis B vaccine

(420.56±55.66 vs  181.62±41.25, t  =  0.013, P<0.05;

403.38±63.85 vs  181.62±41.25; t  =  0.024, P<0.05).

Compared  with  that  in  the  mice  only  injected  with

hepatitis  B  vaccine,  the  serum  anti-HBs  levels  in  the

ones  injected  with  the  combination  of  CpG  ODN  and

hepatitis B vaccine (0.25 and 0.75 μg, respectively)

were  markedly  higher  (181.62±41.25 vs  59.16±18.43,

t = 0.022, P<0.05; 420.56±55.66 vs 241.82±23.84,

t  =  0.018, P<0.05).  The  serum  anti-HBs  levels  in

the  mice  injected  with  the  combination  of  BCG  and

hepatitis B vaccine were not significantly different from

that  with  hepatitis  B  vaccine  only.  Whereas  compared

with  that  in  the  CpG  ODN  combination  groups,  the

serum anti-HBs levels were lower in the mice injected

with the combination of BCG and 0.25 or 0.75 μg

hepatitis  B  vaccine.  The  percentages  of  CD4+  and

the  CD4+/CD8+  ratio  in  the  mice  immunized  by  CpG

ODN  combined  with  hepatitis  B  vaccine  increased

significantly  as  compared  with  those  with  hepatitis  B

vaccine  only  and  the  BCG  combination  group  (CD4+:

38.30±1.68% vs  31.47±2.15%, t  =  0.018, P<0.05;

38.30±1.68 vs  29.31±2.97, t  =  0.013, P<0.05;  CD4+/

CD8+:  9.01±0.38 vs  6.45±0.39, t  =  0.000, P<0.05;

9.01±0.38 vs 6.99±0.79, t = 0.029, P<0.05).

CONCLUSION: CpG  ODN  combined  with  hepatitis  B

vaccine  not  only  induces  high  level  of  anti-HBs,  but

also enhances the cellular immune responses.

Key  Words:  CpG  oligodeoxynucleotide;  Bacilli  Cal-

mette  Guerin;  Hepatitis  B  vaccine;  Anti-HBs;  CD4+;

CD8+

Wang S, Chen Q, Wang X, Zhang Y, Ma L, Wang ZQ. Immunigical

effect  of  hepatitis  B  vaccine  with  CpG  oligodeoxynucleotide  and

BCG on mice. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi  2005;13(17):2078-2081

摘要

目的：观察乙肝疫苗联合CpG ODN和卡介苗免疫小

鼠，对小鼠抗HBs水平和细胞免疫的影响.

World Chin J Digestol  2005 September 15;13(17):2078-2081

世界华人消化杂志 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R2005年版权归世界胃肠病学杂志社

王甦, 等. 乙肝疫苗联合含CpG基序寡脱氧核苷酸和卡介苗对小鼠的免疫应答影响                                                     2079

方法：不同剂量乙肝疫苗单用或联合CpG ODN或卡

介苗免疫小鼠，用ELISA方法检测抗HBs水平，流式

细胞仪检测外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百

分比和比值.

结果：免疫4  w k后，中、高剂量乙肝疫苗联合

CpG ODN组抗HBs水平显著高于低剂量乙肝疫苗

组（420.56±55.66 vs 181.62±41.25，t = 0.013，

P<0.05；403.38±63.85 vs 181.62±41.25；t = 0.024，

P<0.05）.但中、高组间无差别.CpG ODN联合组与

单用乙肝疫苗组比较，联合低、中剂量乙肝疫苗抗

HBs水平较单用乙肝疫苗明显升高（181.62±41.25 vs

59.16±18.43，t = 0.022，P<0.05；420.56±55.66 vs

241.82±23.84，t = 0.018，P<0.05）.但高剂量乙肝疫

苗联合组与单用乙肝疫苗比较两组间未显示明显差

别.且以CpG ODN联合中等量乙肝疫苗产生的抗HBs

水平最高.卡介苗联合组与单用乙肝疫苗组无差别，

但在联合低、中剂量乙肝疫苗抗HBs水平低于CpG

ODN联合组.CpG ODN联合组CD4＋T淋巴细胞百分

比和CD4＋/CD8＋比值明显高于单用乙肝疫苗组和卡

介苗联合组（CD4＋：38.30±1.68 vs 31.47±2.15，

t = 0.018，P<0.05；38.30±1.68 vs 29.31±2.97，

t = 0.013，P<0.05；CD4＋/CD8＋：9.01±0.38 vs 6.45

±0.39，t = 0.000，P<0.05；9.01±0.38 vs 6.99±

0.79，t = 0.029，P<0.05）.

结论：CpG ODN联合乙肝疫苗不仅能诱导出高水平

的抗HBs，而且对细胞免疫也有调节作用.

关键词：CpG ODN；卡介苗；乙肝疫苗；乙肝表面抗体；

CD4+；CD8+

王甦，陈群，王兴，张燕，马丽，汪中强. 乙肝疫苗联合含CpG基

序寡脱氧核苷酸和卡介苗对小鼠免疫应答影响. 世界华人消化杂志

2005;13(17):2078-2081

http://www.wjgnet.com/1009-3079/13/2078.asp

0  引言

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈全球范围广泛流行.HBV感

染可引起急性、慢性和重型肝炎，并与肝硬化、肝

癌的发生密切相关，是严重危害人类健康的感染性

疾病，且目前尚缺乏可靠的治疗方法.因而人们不断

寻求新的预防和治疗措施来控制乙型病毒性肝炎.近

年来，发现细菌DNA中含非甲基化CpG基序具有免疫

刺激作用，人工合成含非甲基化CpG基序的寡脱氧核

苷酸(CpG  oligodeoxynucleotide，CpG  ODN)也有同

样免疫作用[1,2].大量研究表明CpG  ODN不仅能诱导出

高水平的保护性抗体，而且能诱导出强烈的TH1型细

胞免疫应答[3,4].我们探讨含CpG基序的寡脱氧核苷酸

(CpG  ODN)和卡介苗联合乙肝疫苗对小鼠抗HBs水平

和细胞免疫的影响，为乙肝的预防与特异性免疫治疗

提供新的方案.

1  材料和方法

1.1 材料  雌性BALB/c小鼠45只，6-8周龄，清洁级，

每只20-25  g，购于扬州大学实验动物中心.CpG  ODN

碱基序列为5'－TCCATGACGTTCCTGACGTT－3'，由上海

博亚生物技术有限公司合成.乙肝疫苗为北京天坛生

物制品股份有限公司生产.卡介苗为成都生物制品研

究所提供.FITC标记的抗小鼠CD4  mAb和PE标记的抗小

鼠CD8  mAb，对照试剂分别为FITC标记的抗鼠IgG2b,

PE标记的抗鼠IgG2a，购自eBioscience公司.定量检

测乙肝病毒表面抗体(抗HBs)试剂盒购自解放军总医

院东亚免疫所.流式细胞仪为美国Becton-Dickon公司

FACSCalibur.

1.2 方法  经小鼠尾根部皮下免疫BALB/c小鼠.乙肝疫

苗与CpG  ODN混合液配制：乙肝疫苗分低、中、高剂

量（0.25，0.75，1.0 μg），分别溶于20 μg  CpG

ODN.乙肝疫苗与卡介苗混合液配制：乙肝疫苗低、

中、高剂量（0.25，0.75，1.0 μg），分别与0.1 mg

卡介苗溶于注射用水.实验小鼠共分3大组9小组（每

小组5只）.其中，A组单用乙肝疫苗组分:(A1)乙肝疫

苗0.25 μg，(A2)乙肝疫苗0.75 μg，(A3)乙肝疫苗

1.0 μg；CpG  ODN联合乙肝疫苗联合组为B组分:(B1)

乙肝疫苗0.25 μg+CpG ODN 20 μg，(B2)乙肝疫苗0.75

μg+CpG  ODN  20 μg，(B3)乙肝疫苗1.0 μg+CpG  ODN

20 μg；卡介苗联合乙肝疫苗联合组为C组分:(C1)乙

肝疫苗0.25 μg+卡介苗0.1  mg，(C2)乙肝疫苗0.75

μg+卡介苗0.1  mg，(C3)乙肝疫苗1.0 μg+卡介苗0.1

mg.免疫后2及4 wk采小鼠眼球血，分离血清，-20 °C

保存.由专人用同一批号的ELISA检测抗-HBs，操作按

说明书进行，测定吸光度值A450nm.肝素抗凝血，供T淋

巴细胞亚群分析用.方法：50 μL抗凝全血，加FITC

标记的抗小鼠CD4  mAb  1.5 μL，加PE标记的抗鼠CD8

mAb  2.5 μL，室温孵育15  min，避光，然后用NH4C1

低渗溶液2  mL，室温放置8  min，裂解红细胞；低速

离心，去上清，沉淀加PBS 2 mL重悬，再低速离心，

去上清；沉淀加PBS 200 μL重悬上机，开窗于淋巴细

胞区域，计数10000个细胞.机带软件分析CD4＋，CD8＋

T淋巴细胞百分比.

统计学处理 采用SPSS 11软件统计，两组间数据

比较采用t检验.

2  结果

2.1  小鼠抗HBs水平(IU/L) 单用乙肝疫苗组在接

种后2 w k不同剂量产生的抗体产生水平没有明显

差别.C p G O D N联合乙肝疫苗组接种2 w k后显示：

CpG  ODN联合中、高剂量乙肝疫苗其抗HBs水平高于

联合低剂量乙肝疫苗组，也高于单用乙肝疫苗组

高(P<0.05).卡介苗联合乙肝疫苗组接种2 w k后显

示：随着乙肝疫苗的剂量增加，抗体水平逐渐升高

(P<0.05)，且卡介苗联合高剂量乙肝疫苗组明显高于

单用乙肝疫苗组和CpG  ODN联合组(P<0.05，图1).接

种后4 wk后，单用乙肝疫苗组，随着疫苗量的增加，

抗体水平逐渐升高，各组间有显著差异(P<0.05).CpG

ODN联合乙肝疫苗组显示联合中、高剂量乙肝疫苗组

抗HBs水平显著高于联合低剂量乙肝疫苗组(P<0.05).

但中、高组间无差别.卡介苗联合乙肝疫苗组也显示

抗体水平逐渐升高，且各组间也有差异(P<0.05，图

2).同时比较各组间接种4  wk后抗体水平时发现：CpG

ODN联合低、中剂量乙肝疫苗抗HBs水平较单用乙肝疫

苗明显升高(P<0.05).但高剂量乙肝疫苗联合组与单

用乙肝疫苗比较时，两组间未显示明显差别.卡介苗

联合组与单用乙肝疫苗组未显示差别，但在联合低、

中剂量乙肝疫苗组低于CpG  ODN联合组(P<0.05，图

2).单用乙肝疫苗组、CpG  ODN联合乙肝疫苗组以及

BCG联合乙肝疫苗组免疫小鼠2 wk和4 wk后抗HBs水平

的比较均显示各组免疫4 wk后抗体明显高于2 wk时抗体

水平（图3）.

2.2 各组免疫小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化  免疫

4 wk后，CpG ODN联合乙肝疫苗组CD4＋T淋巴细胞百分

2080                             ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R               世界华人消化杂志     2005年9月15日    第13卷   第17期

图1  小鼠免疫2 wk后抗HBs水平.

250

200

150

100

50

0

A                    B                   C

含 低 剂 量 乙 肝 疫 苗

含 中 剂 量 乙 肝 疫 苗

含 高 剂 量 乙 肝 疫 苗

600

500

400

300

200

100

0A                   B                   C

含 低 剂 量 乙 肝 疫 苗

含 中 剂 量 乙 肝 疫 苗

含 高 剂 量 乙 肝 疫 苗

图2  小鼠免疫4 wk后抗HBs水平.

比较单用乙肝疫苗组和卡介苗联合组明显升高，CD4＋

/CD8＋比例升高（P＜0.05）.CD8＋T淋巴细胞百分比与

两组无差别.卡介苗联合组CD4＋、CD8＋T淋巴细胞百分

比、CD4＋/CD8＋比例与单用乙肝疫苗组无明显差别(表1).

表1  不同组别免疫小鼠CD4＋、CD8＋T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值

分组                              CD4+(%)       CD8+(%)          CD4+/CD8+

单用乙肝疫苗                    31.47±2.15      4.89±0.18     6.45±0.39

CpG ODN联合乙肝疫苗    38.30±1.68ac   4.33±0.22     9.01±0.38ac

卡介苗联合乙肝疫苗         29.31±2.97    4.33±0.20     6.99±0.79

aP<0.05 vs 单用乙肝疫苗组，cP<0.05 vs 卡介苗联合乙肝疫苗组.

3  讨论

C p G  O D N对机体各种免疫细胞都具有免疫刺激作

用.CpG  ODN是一些含有CpG二核苷酸，并且具有免疫

激活作用的寡核苷酸.它通过内吞作用和/与Toll样受

体9（TLR9）相互作用能直接影响B细胞、巨噬细胞

和树突状细胞.能引起B细胞分化，直接刺激B细胞分

泌IL6，IL10等细胞因子和免疫球蛋白，诱导B细胞

表面共刺激分子的表达，包括MHCII，B7-1和B7-2.

能直接激活抗原递呈细胞(APC)，包括单核细胞、巨

噬细胞和树突状细胞，诱导其产生IL12，TNF-α等TH1型

为主的细胞因子，并可上调MHC和共刺激分子的表达[3,6,7].

大量动物实验证明[8]，CpG  0DN作为佐剂可增强多种

外源性抗原，包括HBsAg的免疫原性，诱发HBsAg低反

应动物(C57BL6小鼠，新生小鼠)对HBsAg产生体液及

细胞免疫反应，是一种强的Thl型免疫.我们选取雌性

BALB/c小鼠，采用CpG  ODN和卡介苗联合不同剂量乙

肝疫苗免疫小鼠.结果显示CpG  ODN具有明显的免疫

刺激作用.在免疫2  wk后，联合组在联合中、高剂量

乙肝疫苗免疫小鼠其抗HBs水平较单用乙肝疫苗组高

(P<0.05)，表明CpG  ODN能早期提高抗体水平.在免

疫4  wk后，将单用乙肝疫苗组与联合组比较发现，

A1    A2    A3           B1    B2    B3            C1    C2    C3

600

500

400

300

200

100

0

图3  小鼠免疫2 wk和4 wk后抗体水平.

免疫2 wk

免疫4 wk

王甦, 等. 乙肝疫苗联合含CpG基序寡脱氧核苷酸和卡介苗对小鼠的免疫应答影响                                                     2081

细胞免疫的激活可以通过凋亡机制或分泌炎症因子杀

伤病毒感染的细胞或抑制感染细胞中的病毒复制，使

细胞破裂，病毒释放出来，可以通过特异性的抗体与

之中和，使其失去再感染的能力，从而可以达到清除

病毒的目的.

本研究进一步证明CpG  0DN对免疫激活作用，同

时显示CpG  0DN联合乙肝疫苗在适当的比例时，可

产生最好的免疫效果(CpG  0DN联合0.75 μg乙肝疫

苗).因此，如何调整CpG  0DN与疫苗的比例，对更好

地激活机体的免疫反应是非常重要的，也是今后研究

的方向.因此，随着对CpG  0DN研究的深入，CpG  0DN

不仅可用于乙肝疫苗良好的佐剂,  而且也可能是低反

应个体的有效预防性疫苗.CpG  0DN联合乙肝疫苗还可

能成为一种潜在的HBV持续感染患者的治疗性疫苗.

4      参考文献

1 Davis  HL,  Weeratna  R,  Waldschmidt  TJ,  Tygrett  L,  Schorr

J,  Krieg  AM.  CpG  DNA  is  a  potent  enhancer  of  specific

immunity  in  mice  immunized  with  recombinant  hepatitis  B

surface antigen. J Immunol  1998;160:870-876

2 何春艳，刘文良. 包裹天然骨架CpG ODN和HBsAg的非磷脂脂

质体疫苗的免疫效果.  现代免疫学  2004;24:43-47

3 K r i e g  A M ,  Y i  A K ,  M a t s o n  S .  W a l d s c h m i d t  T J ,  B i s h o p

GA,  Teasdale  R,  Koretzky  GA,  Klinman  DM.  CpG  motifs

in  bacterial  DNA  trigger  direct  B-cell  activation. Nature

1995;374:546-549

4 马艳琴，李光富. CpG DNA 的免疫学作用及其应用. 国外医学·

免疫学分册  2003;26:318-321

5 肖昕，徐春光，熊爱华，蒋建伟，徐燕芳. 含CpG基序的寡聚脱

氧核糖核苷酸辅助乙肝疫苗对孕鼠和仔鼠的免疫效果. 实用儿科

临床杂志  2004;19:484-486

6 Bauer  M,  Heeg  K,  Wagner  H,  Lipford  GB.  DNA  activates

human  immune  cells  through  a  CpG  sequence-dependent

manner. Immunology  1999;97:699-705

7 Hemmi  H,  Takeuchi  O,  Kawai  T,  Kaisho  T,  Sato  S,  Sanjo

H,  Matsumoto  M,  Hoshino  K,  Wagner  H,  Takeda  K,  Akira

S.  A  Toll-like  receptor  recognizes  bacterial  DNA. Nature

2000;408:740-745

8 Chu  RS,  Targoni  OS,  Krieg  AM,  Lehmann  PV,  Harding  CV.

CpG  oligodeoxynucleotides  act  as  adjuvants  that  switch  on  T

helper 1 (Th1) immunity. J Exp Med  1997;186:1623-1631

9 常宝祥，赵昌文，王恩杰. 乙肝基因重组疫苗与卡介苗联合免疫

效果观察. 实用新医学  2002;4:332-333

10 崔玉梅，白新卿，裴晓春，梁维民，李群英. 卡介苗优化乙型肝

炎疫苗、白百破、三联疫苗的免疫应答作用. 中国生物制品学杂

志  1994;7:80-82

编辑  潘伯荣  审读  张海宁

CpG  ODN联合低、中剂量乙肝疫苗较单用乙肝疫苗明

显升高(P<0.05).但CpG  ODN联合高剂量乙肝疫苗与单

用乙肝疫苗(1.0 μg)比较时，两组间未显示明显差

别.同时免疫4  wk后，联合组显示CpG  0DN联合中、

高剂量乙肝疫苗组显著高于联合低剂量乙肝疫苗组

(P<0.05).但中、高组间无差别.而且我们发现C p G

ODN联合中等剂量乙肝疫苗(0.75 μg)产生的抗体水平

最高.肖昕 et al[5]在用不同剂量CpG  ODN(10，20，

40 μg)联合乙肝疫苗免疫小鼠，同样也观察到抗体

水平不随CpG  ODN剂量的增加而增加.Davis[1]研究发

现，少至10 μg量的CpG 0DN就可以获得很完全的免疫

刺激效果.因此，如果CpG  0DN剂量太少，刺激强度不

够，则会影响免疫效力；而如果CpG  0DN剂量太大，

则可能会增加不良反应，且造成不必要的浪费.提示

CpG  ODN与疫苗需有适当比例，才能产生较好的免疫

作用.我们从另一角度(通过改变乙肝疫苗的量)阐明

CpG ODN与乙肝疫苗适当比例可能产生较好的免疫效果.

目前大多研究显示卡介苗联合乙肝疫苗对HBsAb

的产生，有增强和优化作用[9,10].本研究显示，卡介

苗联合乙肝疫苗组与单用乙肝疫苗组比较，免疫2  wk

后，高剂量乙肝疫苗联合卡介苗组抗体水平较单用高

剂量乙肝疫苗高，但其它两组间无差别；且免疫4  wk

后，联合组与单用组无差别.在与CpG  ODN联合组比

较时，4  wk后，低、中剂量联合组抗体水平低于CpG

ODN联合组(P<0.05).说明卡介苗联合乙肝疫苗，没有

明显增加抗体水平，有待进一步研究.应用流式细胞

对T淋巴细胞CD4＋和CD8＋亚群分析显示：CpG ODN联合

组CD4＋T淋巴细胞百分比明显高于单用乙肝疫苗组和

卡介苗组(P<0.05)，CD8＋T淋巴细胞百分比两组无明

显差别.CD4＋/CD8＋比值CpG  ODN联合组也明显高于单

用乙肝疫苗组和卡介苗组(P<0.05).因而可以看出，

乙肝疫苗联合CpG  ODN不仅能诱导出高水平的抗HBs，

而且对细胞免疫也有调节作用.这种体液／细胞免疫

均衡应答对治疗慢性乙型肝炎可能是很有价值的：抗

体能降低病毒载量和防止HBV对未感染细胞的感染；