蛋白纯化表达实验技术介绍

蛋白纯化表达实验技术介绍一、技术概述蛋白纯化表达技术是通过基因工程手段将目标蛋白在宿主细胞（如大肠杆菌）中高效表达，并通过亲和层析（如Ni-NTA纯化）结合物理化学方法（超声破碎、离心分离）获得高纯度蛋白的核心技术。二、实验目的本实验基于Rosetta(DE3)感受态细胞与IPTG诱导表达系统，结合SDS-PAGE电泳与考马斯亮蓝染色进行表达验证，最终通过Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白，为功能研究、结构解析及药物开发提供高质量蛋白样品。三、实验流程1.质粒转化

a.将感受态细胞置于冰上融化;

b.取10ng质粒加入至100 µL Rosetta(DE3)感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30 min。

c.将离心管置于 42℃水浴中 80 秒，然后快速转移到冰浴中放置 3 分钟，注意不要摇动离心管;

d.加入300 µL无菌无抗生素 LB培养基，混匀， 37 °C、200 rpm振荡培养1 h;

e.于超净工作台中，将菌液均匀涂布于含抗生素（100 μg/mL）的LB平板上，室温下放置，至液体吸收。

f.倒置平板，转移入37 °C生化培养箱过夜培养。

2.扩大培养

a.转移阳性单菌落到40ml LB液体培养基扩培（提前加入对应抗生素）；

b.等培养基比较混浊时，取1ml菌液标记为诱导前，加入40ul  25mg/ml 的IPTG诱导剂进行诱导3h；

3.超声破碎

a.诱导好的菌，1000g离心收集细胞沉淀，加入2ml 细胞裂解液,20ul蛋白酶抑制剂，20ul PMSF;超声条件：功率：30%、超3s、停5s 超声时间25min;

b.12000g离心；转移上清至新的离心管中；

4.表达形式鉴定：

a.配制12%SDS-PAGE胶

b.取诱导前的样本100ul与超声后的样本100ul 加入25ul 5×loading进行沸水浴10min;然后100V电泳；

c.超声后的样本12000g离心10min;取上清和沉淀分别进行电泳；

5.马斯亮蓝染色

电泳后的胶进行考马斯亮蓝染色；染色15min;终止染色；弃染液后，加入自来水，用微波炉煮样，期间多次换水；将胶煮透明。

6.蛋白质纯化（详细操作步骤参考 生工蛋白纯化试剂盒/Ni-NTA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒）

a.取超声破碎后的菌液，加入适量的Binding buffer,混匀后直接过柱。

b.用washing buffer进行洗涤，洗涤5次；

c.加入洗脱液进行洗脱。

7.蛋白浓度测定

用Nano-800进行蛋白浓度测定

四、技术优势

✅  灵活诱导：IPTG浓度与温度可调，适配可溶性表达或包涵体优化

✅  高纯度蛋白：Ni-NTA纯化后纯度>90%，满足结构生物学需求

✅  快速验证：SDS-PAGE结合考马斯亮蓝染色，1天内完成表达分析

五、适用范围

1️⃣ 重组蛋白生产：原核/真核表达系统优化

2️⃣抗体开发：抗原制备与纯化

3️⃣ 酶学研究：活性蛋白的获取与功能验证

六、代表性实验结果

七、客户提供

1

细胞样品: ＞2×107；细胞培养上清≥1ml

动植物组织/细菌、真菌样品: ＞100mg（黄豆粒大小）；

血清、血浆、全血及其他体液样品: ＞200μl；

RNA/DNA/cDNA: v≥10μl，c≥50ng/μl

2

物种信息及基因信息