RIP（RNA免疫沉淀）实验技术介绍

RIP（RNA免疫沉淀）实验技术介绍

一、技术概述

RIP（RNA Immunoprecipitation）是一种通过特异性抗体富集与目标蛋白结合的RNA分子的技术，广泛应用于研究RNA与蛋白质的相互作用。本技术利用抗体捕获RNA结合蛋白（RBP）及其结合的RNA，结合高通量测序（RIP-Seq）或qPCR分析，可精准解析RNA-蛋白互作网络，揭示其在基因表达调控、疾病发生及细胞功能中的关键作用。

二、实验目的

本技术主要包括RIP-qPCR和RIP-seq两种;其中RIP-qPCR用来验证与目标蛋

白结合的已知RNA，RIP-seq用来筛选与目标蛋白结合的未知 RNA。

三、实验流程

（一）细胞裂解

1.HTR-8冻存细胞解冻后1500rpm，离心1min，去上清。

2.每1x107个细胞加入500µl的RIPA裂解液。

3.每ml RIPA裂解液加10µl的PMSF以及磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，

再加入10µl的10%SDS和tritonX-100，翻转裂解过夜，-20℃保存。

（二）抗体验证：

1.先配置12%的分离胶，加异丙醇静置20min，待分离胶凝固，吸除异丙醇再用水冲

洗残余的异丙醇，吸水纸吸去残液。加入配置好的5%的浓缩胶，插入梳子，静置20min，待浓缩胶凝固后拔出梳子。

2.安装好电泳装置，上样，先70V,15min，后120V，90min。

3.转膜，湿转120V稳压转100min。

4.封闭，将醋酸纤维膜放入5%的脱脂牛奶中，封闭30min。

5.PBS洗膜3次，每次5min。

6.孵育一抗（1：AGO2,PBS稀释），4℃孵育过夜。

7.PBS洗膜3次，每次10min。

8.孵育二抗（1：1000，PBS稀释），室温孵育2h。

9.PBS洗膜3次，每次10min。

10.按1：1的比例加入试剂盒中的两种发光剂，孵育1min。

11. 把NC膜放到载物台，用化学发光仪进行信号采集。

（三）磁珠与抗体结合：

1.标记实验所需的1.5ml EP管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照。

2.吸取50µl重悬后的磁珠悬液于每个1.5ml EP。

3.每管加入500µl RIP Wash Buffer，涡旋震荡。

4.将1.5ml EP管置于磁力架上，并左右转动15º，使磁珠吸附成一条线，去上清，重复一次

5.用100µl的RIP Wash buffer重悬磁珠，加入约5µg 相应抗体于每个样品中，室

温孵育30min。

6.将1.5ml EP管置于磁力架上，弃上清。

7.加入500µl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次。

8.加入RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上。

（四）磁珠抗体复合物与蛋白结合：

1.将上一步的EP管放磁力架上，去上清，每管加入900µl 表2所示的RIP Immunoprecipitation Buffer。

表2 RIP Immunoprecipitation Buffer配比

RIP Wash Buffer 860µl

0.5M EDTA 35µl

RNase Inhibitor 5µl

Total 900µl

2.迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心10min。吸取

100µl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml。4℃孵育3h至过夜

3.孵育完后，短暂离心，将EP管放磁力架上，去上清，加入500µl RIP Wash

Buffer，涡旋震荡后将EP管放磁力架上，去上清，重复5次，总共清洗6次。

（五）RNA洗脱：

1.用150µl表3所示的Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物，55℃孵育30min。

表3 Proteinase K Buffer配比

RIP Wash Buffer 117µl

10%SDS 15µl

Proteinase K 18µl

Total 150µl

2.孵育完后，将EP管放磁力架上，将上清吸入一新的1.5ml EP管中，于每管中加入250µl RIP Wash Buffer。

（五）RNA纯化：

1.  Input样品及sense、antisense、beads 样本分别加入1ml TRIZOL, 颠倒混匀 15 s；

3.  13000 g、4℃离心 10 min，收集上层水相，转移到新无 RNA 酶离心管中；

4.  分别加入 5 µL 糖原（1ug/ul），500 µL 异丙醇充分颠倒混匀；

5.  -80℃过夜沉淀 RNA 样品；

6.  13000 g、4℃离心 10 min，弃上清；

7.  分别加入 1 mL 预冷的 75%乙醇，10000 g、4℃离心 5min，弃上清，室温静置风干 10min；

8.  加入15ul DEPC处理水，溶解RNA。

（六）RNA反转录：

1.  按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。

试剂组分 使用量 终浓度

5×PrimeScript Buffer（for Real Time） 2uL 1×

PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5uL

Random 6 mers（100 μM）*1 0.5uL 50 pmol

RNA 7 uL

2.  按如下程序进行反转录：

37℃,15min；85℃，5sec；-20℃保存备用！

3． 定量PCR检测

1） 将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2） 冰上配制下表中的反应液

成分 加入量 终浓度

Hieff qPCR SYBR® Green Master Mix (low Rox) 5μL 1×

Forward Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM

Reverse Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM

cDNA（diluted 1:5） 2μL

RNase-free Water to 10μL

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

循环数 步骤 温度 时间 荧光采集

1 预变性 95℃ 5min No

40 变性 95℃ 10s No

退火 60℃ 30s Yes

上述反应结束后，从60℃～95℃过程中进行熔解曲线分析

四、技术优势

✅ 高特异性：经验证抗体确保靶标蛋白的高效富集

✅ 兼容性强：支持多种RNA类型（mRNA、lncRNA、miRNA）

✅ 低背景干扰：严格洗涤步骤及对照设计（IgG、Input）确保数据可靠性

五、适用范围

1️⃣ RNA结合蛋白研究

2️⃣ 非编码RNA功能

3️⃣ 疾病机制探索（癌症、神经疾病中异常RNA-蛋白互作的分子基础）

4️⃣ 药物靶点筛选

六、代表性实验结果