染色质免疫沉淀（CHIP）实验技术介绍

染色质免疫沉淀（CHIP）实验技术介绍

一、技术概述

染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，简称CHIP）是一种强有力的分子生物学技术，是检测转录因子等蛋白与DNA之间相互作用的主要实验方法之一。通过该技术，可以深入揭示基因调控机制，为转录调控网络的研究提供关键数据支持。

二、实验目的

本次实验以HIF1A蛋白为研究对象，利用CHIP技术联合qPCR检测，验证其是否与目标启动子区域结合及其结合位点，揭示其在转录调控中的关键作用。

三、实验流程

1. 细胞交联

a. 用1ml PBS重悬细胞；

b. 加28ul 37%甲醛（终浓度为1%）进行交联，室温翻转孵育10min；

c. 加入10×甘氨酸至终浓度为1×；室温翻转孵育5min，终止交联；

d. 4℃，3000g，离心5min；弃上清液；

e. 用1ml预冷的1X PBS重悬细胞，用3000g，4℃，离心5min，去上清;

f. 重复e步骤一遍（此步骤沉淀可冻存于-80℃）；

2. 胞核制备和染色质碎裂

a.  用200ul Membrane Extraction Buffer(使用前加入2ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂)重悬细胞；冰上静置10min；

b.  4℃，9000g，离心3min；弃上清液;

d. 用200ul MNase Digestion Buffer （使用前加入0.2ul DTT）重悬细胞核;

d. 加入0.2ul MNase ,吹打混匀；37℃水浴15min，期间5min混匀一次；

e. 加入20μL MNase Stop Solution；混匀后冰上放置5min;

f. 4℃，9000g，离心5min；弃上清液；

g. 用500μL of 1X IP Dilution Buffer（使用前加入5ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂）重悬沉淀；

h. 冰上超声打断5次，每次2min;（超2s，停4s）

i. 4℃,9000g离心5min;转移上清到新的EP管中

3. 免疫沉淀

a. 取220ul上清作为input,-20℃冻存备用；

b.  分别取220ul上清到两个新的EP管中，标记为IP与IgG; IP组加入10ug目的抗体（或10ul阳性抗体）；阴性对照组加入2μL IgG ;

c.  样本管放到翻转仪4℃翻转孵育过夜；

d.  震荡混匀Protein A/G磁珠，分别加20ul磁珠到IP与IgG组中；

e． 样本管放到翻转仪4℃翻转孵育2h；

f.   将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；

g.   加入1ml  IP Wash Buffer，并吹打混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；

h． 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；

i.   重复步骤g~h 2次，即共洗涤3次；

j.   加入1ml IP Wash Buffer 2，并吹打混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；

k.   将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；

4. 洗脱

a.  加入150ul 1X IP Elution Buffer重悬磁珠，65℃震荡孵育30min；（如果无法震荡孵育，则65℃水浴40min;并每10min混匀一次）

b. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，将上清转移到一个新的EP管中；

c.  input样本中加入150ul 1X IP Elution Buffer；

d.  各样本中分别加入6μL  NaCl(5M) 、2μL 蛋白酶K(20mg/Ml);

e.  吹打混匀，65℃孵育1.5h;

f.  每样本加入750μL  DNA Binding Buffer，吹打混匀；

g.  吸500ul样本到DNA Clean-Up Column；室温10,000 × g 离心1 min；

h．弃滤液，把剩余的样本加入到DNA Clean-Up Column；室温10,000 × g 离心1 min；

i.  弃滤液，加入750ul  DNA Column Wash Buffer；室温10,000 × g 离心1 min；

j.  弃滤液，把吸附柱重新放回收集管,室温10,000 × g 离心2min；

k.  将吸附柱转移到一个新的1.5ml EP管中，加入50μL DNA Elution solution 到吸附柱；

l.  室温10,000 × g 离心2min;得到的洗脱液即为CHIP产物。可直接用于后续qPCR或测序（注意：进行qPCR检测时需按等体积投入）

5. qPCR检测

a. 将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心；

b. 冰上配制下表中的反应液

成分 加入量 终浓度

HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (low Rox) 5μL 1×

Forward Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM

Reverse Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM

DNA 2μL

RNase-free Water to 10μL

c. 将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

d. 采用三步法程序进行反应：

循环数 步骤 温度 时间 荧光采集

1 预变性 95℃ 5min No

40 变性 95℃ 10s No

退火 60℃ 30s Yes

上述反应结束后，从60℃～95℃过程中进行熔解曲线分析

四、技术优势

✅ 高特异性：采用高亲和力抗体与优化的免疫沉淀方案，有效降低背景噪音。

✅ 高灵敏度：结合SYBR Green荧光检测系统，实现低拷贝DNA序列的精确放大与检测。

✅ 强可视化数据：电泳图、qPCR柱状图等结果清晰直观，方便数据解释与发布。

✅ 可拓展性强：CHIP产物可直接用于qPCR、测序（CHIP-seq）等多种下游应用。

五、适用范围

1️⃣转录因子-DNA结合位点筛查

2️⃣染色质修饰与表观遗传研究

3️⃣基因表达调控机制研究

4️⃣药物作用机制探索

六、代表性实验结果

CHIP-qPCR柱状图：直观展现HIF1A蛋白在目标区域的结合强度。

抗体验证与电泳图：验证抗体特异性与片段化程度，为实验数据保驾护航。

注：1、如ChIP结束后进行检测，input作为对照；如结束后进行q-PCR,则需要提供预测靶基因结合位点的具体序列或目标靶基因的名称、序列或GeneBank ID。