质粒全测序（7000bp内）实验技术介绍

质粒全测序（7000bp内）实验技术介绍

一、技术概述

质粒全测序是通过一代测序技术（Sanger测序）对质粒DNA的完整序列进行精准解析，确保质粒构建的正确性、插入片段的完整性及无突变存在。本实验结合高纯度质粒小提试剂盒（TIANpure Mini Plasmid Kit）提取高纯度质粒DNA，并通过多轮引物步移测序策略，覆盖质粒全序列，为基因克隆、载体验证及功能研究提供可靠数据支持。  二、实验目的

1. 验证质粒构建：确认插入片段序列、方向及连接位点无突变；

2. 检测载体完整性：确保质粒骨架（如启动子、抗性基因）无意外缺失或插入；

3. 辅助功能研究：为基因表达、蛋白互作及转基因实验提供精准序列信息。

三、实验流程

1. 质粒提取

基于TIANpure Mini Plasmid Kit进行质粒提取（详情参见试剂盒说明书）

2. 测序引物设计与测序

a. 通用引物初测：使用载体通用引物（如T7/SP6）对插入片段两端进行初步测序；

b. 步移引物设计：根据初测结果设计新引物，逐步延伸覆盖全长序列；

c. 测序反应：采用Sanger测序法，通过荧光标记ddNTP终止扩增，生成测序峰图；

d. 序列拼接：将多段测序结果拼接为完整质粒序列，确保无缺口或矛盾位点。

四、技术优势

✅  精准测序：一代测序准确率>99.9%，可检测单碱基突变

✅  灵活覆盖 ：支持多轮引物步移，适配复杂载体或长片段插入

✅  高纯度质粒：通过高纯度试剂盒提取质粒，适用于敏感实验（如转染、测序）

五、适用范围

1️⃣ 基因克隆验证：重组质粒插入片段与载体连接位点确认

2️⃣ 突变体筛选：定点突变或随机突变文库的序列鉴定

3️⃣ 合成生物学：人工合成质粒的功能元件完整性检测

4️⃣ 科研与工业应用：GMP级质粒生产质控、疫苗研发载体验证

六、代表性实验结果

七、提供

1 细胞样品: ＞2×107；细胞培养上清≥1ml

动植物组织/细菌、真菌样品: ＞100mg（黄豆粒大小）；

血清、血浆、全血及其他体液样品: ＞200μl；

RNA/DNA/cDNA:  v≥10μl，c≥50ng/μl

2 物种信息及基因信息

（注：组织样品需液氮速冻、保存于-80度，样品使用干冰寄送）