MERIP实验技术介绍

MERIP实验技术介绍

一、技术概述

MERIP（Methylated RNA Immunoprecipitation）是一种通过特异性抗体富集甲基化修饰RNA的技术，结合高通量测序（如MeRIP-Seq），可全基因组水平解析RNA甲基化（如m6A、m5C等）的分布、丰度及其生物学功能。本技术通过免疫沉淀甲基化RNA片段，揭示RNA表观修饰在基因表达调控、疾病发生及细胞命运决定中的关键作用，为表观转录组学研究提供核心工具。

二、实验目的

本实验利用m6A抗体结合并沉淀具有m6A修饰的RNA片段，然后通过qPCR验证

RNA HIF1A是否被甲基化及甲基化位点。

三、实验流程

（一）RNA提取

1.样本前处理：收集 1×10^7细胞后，用预冷的 1×PBS漂洗两次，1000 rpm 室温离心 5 min，去上清；

2.向细胞中加入 1 mL Trizol 裂解，吹打至完全看不到细胞团块，室温放置 5 min；

3.按 1 mL Trizol 加入 200 μL 氯仿，盖好管盖（注意：此次一定要盖好盖子，避免震荡过程中液体渗出）。用手剧烈震荡 15 s，室温放置 3 min；

4.12000 g、4℃离心 15 min；

5.小心转移上清液（约500 μL）至新的 1.5 mL 无酶离心管中；

6.加入等体积异丙醇，室温静置10min；（若预期RNA量比较少，可加入适量糖原，并于-20℃或-80℃沉淀过夜；）

7.12000 g、4℃离心 10 min；弃掉上清，保留沉淀；

8.加入 1 mL 75％乙醇，颠倒混匀；

9.7500 g、4℃离心 5 min；弃掉上清；

10.7500 g、4℃离心 30s，用10ul小枪头尽量吸掉残留的液体；

11.室温静置5~10min，晾干乙醇；（看到RNA变半透明即可）

12.加入适量RNase-free水溶解RNA,室温静置10min，令RNA可以充分溶解；

13.RNA冻存到-80℃冰箱备用。

（二）RNA片段化

1.  RNA 样品中加入 等体积的frag buffer,吹打混匀；

2.  94℃孵育6min；

3.  用酚氯仿回收RNA;

4.  配制 1%琼脂糖凝胶检测 RNA 片段大小；

5.  取2 μL RNA 样品作为 Input 样品-80℃保存备用；

6.  取分别取 20 μL RNA 样品作为m6A组及IGG组。

（三）免疫沉淀

1.  m6A 组及IgG组分别中加入 4μg m6A 抗体及IgG抗体，置于垂直混匀器 4℃孵育过夜（16h）。

(五)  protein A/G 与抗体结合

1.  取出protein A/G 磁珠，并充分震荡混匀；m6A组及IgG组中分别加入20ul磁珠，垂直混匀器 4℃孵育2 h；

2.  把样本置于磁力架上，静置1min，吸除上清；

3.  向EP管中加入200ul洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀；并于垂直混匀器 4℃洗涤 5 min；

4.  把样本置于磁力架上，静置1min，吸除上清；

5.  重复3与4步骤3次。

(六)  RNA纯化回收

1.  input、m6A、IgG样本分别1 mL Trizol 裂解液；

2.  吹打混匀并置于垂直混匀器4℃裂解15min；

3.  按照（一）步骤，纯化回收RNA;

(六)  RNA 反转录

1.  按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。

试剂组分 使用量 终浓度

5×PrimeScript Buffer（for Real Time） 2uL 1×

PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5uL

Random 6 mers（100 μM）*1 0.5uL 50 pmol

RNA 7 uL

注意：注意反转录步骤RNA投入量按等体积进行，后续实验稀释及上机检测皆按比例进行。

2.  按如下程序进行反转录：

37℃,15min；85℃，5sec；-20℃保存备用！

3． 定量PCR检测

1） 将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2） 冰上配制下表中的反应液

成分 加入量 终浓度

Hieff qPCR SYBR® Green Master Mix (low Rox) 5μL 1×

Forward Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM

Reverse Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM

cDNA 2μL

RNase-free Water to 10μL

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

循环数 步骤 温度 时间 荧光采集

1 预变性 95℃ 5min No

40 变性 95℃ 10s No

退火 60℃ 30s Yes

上述反应结束后，从60℃～95℃过程中进行熔解曲线分析

四、技术优势

✅ 高特异性：经验证的甲基化抗体，确保低假阳性率

✅ 单碱基分辨率：结合MeRIP-Seq，精确定位修饰位点；

✅ 多组学整合：与转录组、蛋白质组数据联合分析，揭示多维调控网络

五、适用范围

1️⃣ 基础研究：RNA甲基化在发育、分化及应激反应中的动态调控

2️⃣ 疾病机制：癌症、神经退行性疾病中异常RNA甲基化的功能解析

3️⃣ 药物开发：靶向RNA修饰酶（如METTL3、FTO）的抑制剂筛选

4️⃣ 农业科学：作物抗逆性与RNA表观修饰的关联研究

六、代表性实验结果