基因相对表达量检测（QPCR）实验技术介绍

基因相对表达量检测（QPCR）实验技术介绍

一、技术概述

SYBR Green荧光染料法是一种基于双链DNA结合染料的实时荧光定量PCR（qPCR）技术。SYBR Green染料可非特异性嵌入双链DNA的小沟中，释放荧光信号，通过实时监测荧光强度反映PCR扩增进程。该方法经济高效，适用于基因表达差异分析、病原体检测及功能基因组学研究。

二、实验目的

本实验通过在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

三、实验流程

1、总RNA抽提

1）样品前处理：取约100 mg组织样品至冷冻研钵中，加入液氮研磨至粉末状，转移至装有1 mL RNAiso Plus的1.5mL离心管中，振荡混匀后室温静置约5min。

2） 相分离: 每1mL RNAiso Plus加入0.2mL氯仿，振荡混匀15s后室温静置约3min，4℃，12000rpm，离心15min。

3）沉淀：转移水相至新的1.5mL离心管中，每1mL RNAiso Plus加入0.5mL异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃，12000rpm，离心10min。

4）洗涤：弃上清，每加入1mL75%的乙醇，混匀后4℃，7500rpm，离心5min。

5）溶解: 弃上清，空气干燥RNA沉淀约5min（注意不要完全干燥，只需沉淀泛白即可），加入适量的DEPC处理水溶解RNA沉淀。

6）测定浓度和纯度：用分光光度计测定RNA浓度和纯度后记录数据。

2、反转录反应

1）按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。

试剂组分 使用量 终浓度

5×PrimeScript Buffer（for Real Time） 2uL 1×

PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5uL

Oligo dT Primer（50μM）*1 0.5uL 25 pmol

Random 6 mers（100μM）*1 0.5uL 50 pmol

Total RNA 1μg

RNase Free dH2O 补足至10 uL

2）按如下程序进行反转录：

37℃,15min；85℃，5sec。-20℃保存备用！

3、定量PCR检测

1）将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2）冰上配制下表中的反应液

成分 加入量 终浓度

HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox) 5μL 1×

Forward Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM

Reverse Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM

cDNA 2μL

RNase-free Water to 10μL

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

循环数 步骤 温度 时间 荧光采集

1 预变性 95℃ 5min No

40 变性 95℃ 10s No

退火 60℃ 30s Yes

上述反应结束后，从60℃～95℃过程中进行熔解曲线分析

四、技术优势

✅ 特异性：检测所有双链DNA扩增产物，包括非特异反应产物，如引物二聚体。

✅ 适用性：可对任何双链DNA进行定量，适用于大量基因的分析。

✅ 操作简便：不需要探针，从而减少了实验设计及运转成本。

四、适用范围

1️⃣ 临床疾病诊断

2️⃣ 动物疾病检测

3️⃣ 食品安全检测

六、代表性实验结果

七、提供

1 细胞样品: ＞2×107；细胞培养上清≥1ml

动植物组织/细菌、真菌样品: ＞100mg（黄豆粒大小）；

血清、血浆、全血及其他体液样品: ＞200μl；

RNA/DNA/cDNA:  v≥10μl，c≥50ng/μl

2 物种信息及基因信息

（注：组织样品需液氮速冻、保存于-80度，样品使用干冰寄送，避免污染和反复冻融）