miRNA 相对表达量检测技术介绍

miRNA 相对表达量检测技术介绍

一、技术概述

miRNA检测是一种检测生物体内miRNA表达情况的技术，包括Northern杂交、微阵点分析、实时定量PCR等。检测miRNA的表达丰度，对疾病的诊断和治疗具有一定的意义。

二、实验目的

本实验采用实时定量PCR法（QPCR)检测miRNA的相对表达量。主要是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。既可检测miRNA前体，又可检测成熟miRNA的表达。

三、实验流程

1、RNA抽提

取200 uL血清样品至1.5ML的EP管中，加入900 uL裂解液MZA，严格按照“miRcute Serum_Plasma miRNA Isolation Kit”说明书步骤进行提取，详见说明书附件。

2、反转录反应

1）按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。

试剂组分 使用量

5×PrimeScript Buffer（for Real Time） 2uL

PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5uL

特异反转录引物（10 μM） 0.3uL

Total RNA 500ng

RNase Free dH2O 补足至10 uL

2）按如下程序进行反转录：

37℃,15min；85℃，5sec。

-20℃保存备用！

3、定量PCR检测

1）将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2）冰上配制下表中的反应液

成分 加入量 终浓度

HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox) 5μL 1×

Forward Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM

Reverse Primer (10μM) 0.2μL 0.2 μM

cDNA 2μL

RNase-free Water to 10μL

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

循环数 步骤 温度 时间 荧光采集

1 预变性 95℃ 5min No

40 变性 95℃ 10s No

退火 60℃ 30s Yes

上述反应结束后，从60℃～95℃过程中进行熔解曲线分析

四、技术优势

✅ 高灵敏度：实时定量PCR可以高度灵敏地检测出低丰度表达的靶分子，因此常用于miRNA表达谱结果的鉴定。

✅ 定量准确：可实现对miRNA表达量的精确定量分析，为研究miRNA在不同生理病理状态下的表达变化提供可靠的量化数据。

✅ 操作简便：有成熟的试剂盒和自动化仪器，实验流程相对简单；不需要探针，从而减少了实验设计及运转成本。

四、适用范围

1️⃣ 基础生物学研究（如研究胚胎发育过程中不同阶段miRNA表达变化）

2️⃣ 疾病研究（如检测肿瘤组织和正常组织中miRNA表达差异）

3️⃣ 药物靶点筛选、药物疗效评估等药物研发应用

六、代表性实验结果

七、提供

1 细胞样品: ＞2×107；细胞培养上清≥1ml

动植物组织/细菌、真菌样品: ＞100mg（黄豆粒大小）；

血清、血浆、全血及其他体液样品: ＞200μl；

RNA/DNA/cDNA:  v≥10μl，c≥50ng/μl

2 物种信息及基因信息

（注：组织样品需液氮速冻、保存于-80度，样品使用干冰寄送，避免污染和反复冻融）