WB实验｜封闭液的选择影响条带质量❗️

任兴趣学 任性去学 游学团 个人感觉条带是否清晰，除了和一二抗关系比较大，封闭也是一个很重要的步骤… [向右R]封闭液的选择主要基于抗体和目标蛋白，日常内参，一些本底较高的蛋白用脱脂牛奶封闭没问题；磷酸化蛋白可采用BSA和快封，如若丰度低或测分泌蛋白个人比较推荐使用成品快封，脱脂牛奶和BSA效果其实都不太稳定。 简单说一下常用封闭液的使用⚠️ ✅1、5%脱脂牛奶 封闭时间：室温1-2h或4度过夜。 一般5%脱脂牛奶pH大约为6左右，有说脱脂奶粉需调PH到7的，但感觉不调pH也可以做出来 奶粉最大的优点是亲民，但适用蛋白少一些。内参 or 本底丰度比较高的蛋白 or 一抗好用的情况下用脱脂牛奶封闭没问题 ⚠️注意事项： 1、日常保存放4度，变质析出后不要再继续使用，配置新的5%脱脂奶粉 2、配置新的5%脱脂奶粉时用磁力搅拌使其充分溶解，充分溶解后再使用（无细小颗粒） ✅2、BSA（牛血清白蛋白） 封闭时间：室温1h，对于一些背景非常高的抗体，可以4℃过夜。除了脱脂奶粉之外，比较常用的封闭剂，浓度可选5% 虽然BSA是单一蛋白，但也可能含IgG等污染物，会增加非特异性背景 磷酸化蛋白建议采用BSA或快封，BSA效果不算稳定，如果封闭一般，直接上快封 ✅3、全血清 通常使用的浓度为 5-10% 使用率较低，价格昂贵 对比脱脂奶粉和BSA也没有什么好处，但血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间的结合，BSA无法封闭Fc受体，一般不选择！ ✅4、成品快速封闭液 封闭时间很快，基本只需要10-15min即可 也有一些是需要30min，但30min的快封我不考虑使用，每个成品封闭液都有自己的Protocol，基本照做就没问题，我用的亲和生命的～只需要封闭10min，我日常是回收使用，封闭完一次后再留着再二次使用，大概可以重复利用4次，也能做ELISA，IHC… 这种封闭液比脱脂奶粉和BSA好的地方是里面不含有各种乱七八糟的增强背景的蛋白成分