三、实验流程
1、捕获蛋白制备
1）取细胞沉淀;;
2）加入1mL IP lysis buffer(预先加入Protease inhibitor及PMSF)
3）30%功率，超2秒停6秒，进行超声破碎；
4）17000g，4℃离心10min；转移上清到一个新的1.5mL离心管中；
5）取30ul上清样本作为input,-80℃保存备用。
6）剩余样本用于后续pull down 实验。
2、诱饵蛋白制备
1）取诱导成功的 GST-诱饵蛋白表达大肠杆菌菌液50mL，4000 g离心 10 min，去除上清培养基；
2）加入50 mL PBS吹打混匀后，1500g 离心 5 min，去除上清；
3）加入2 mL PBS并加入20 ul Protease inhibitor 和 20 ul PMSF，吹打混匀；
4）在超声波破碎仪上冰浴超声样品至溶液透亮；
5）4℃，17000g 离心超声破碎样品 10min，转移上清到新的EP离心管中
3、磁珠准备
1）将GSH 磁珠颠倒混匀后，分别取 500ul GSH 磁珠到1.5ml离心管中，将离心管置于磁力架上静置3min;待澄清后弃上清；
2）加人 500μL Wash buffer，颠倒混匀，置于磁力架上静置3min，待澄清后弃上清，重复洗涤1 次；
4、诱饵蛋白与磁珠结合
1）将新鲜制备的诱饵融合蛋白及GST蛋白，分别加入到准备好的GSH 磁珠中；
2）4℃，垂直混匀器上摇动孵育 30min；
3）置于磁力架上静置3min，待澄清后弃上清；
4）加入预冷的500μL Wash buffer， 4℃垂直混匀器上摇动 5min洗涤，置于磁力架上静置3min，待澄清后弃上清；
5）重复上上步骤2次，即共洗涤3次；
5、GST-pulldown
1）分别向步骤 4获得的GST- 诱饵蛋白及GST蛋白管中加入450μL捕获蛋白裂解液；
2）4℃，垂直混匀器上翻转孵育过夜；
3）置于磁力架上静置3min，待澄清后弃上清；
4）磁珠加入预冷的500μL Wash buffer，随后 4℃颠倒混匀5min，置于磁力架上静置3min，待澄清后弃上清；
5）重复上步骤4次，即共洗涤5次。
6）分别加入80μL Elution buffer，沸水浴变性洗脱 10min；
7）磁力架静置吸附磁珠，收集上清-80℃保存；
6、银染检测
1）固定：电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液（配方见表2）中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为60-70rpm。
表2 固定液配置
乙醇
50ml
乙酸
10ml
ddH2O
40ml
Total
100ml
2） 30%乙醇洗涤：弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
3）水洗涤：弃30%乙醇，加入200ml双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
4）增敏：弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。
5）水洗涤(共2次)：弃原有溶液，加入200ml双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。
6）重复步骤5
7）银染：弃水，加入100ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
8）水洗涤：弃原有溶液，加入100ml双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5分钟，摇动速度为60-70rpm。
9）显色：弃水，加入100ml银染显色液，在摇床上室温摇动3-10分钟，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70rpm。
10）终止：弃银染显色液，加入100ml银染终止液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。
11）水洗涤：弃银染终止液，加入100ml双蒸水，在摇床上室温摇动2-5分钟，摇动速度为60-70rpm。在双蒸水中保存或制成干胶。
四、技术优势✅ 高特异性：GSH磁珠专一结合GST标签，背景干扰低
✅ 灵活兼容：适用于可溶性蛋白或细胞裂解液中的互作研究
✅ 高灵敏度：银染检测可检测低至1 ng蛋白
✅ 广泛适用：支持体外互作、结构域映射及药物靶点筛选
五、适用范围1️⃣蛋白互作验证：验证酵母双杂交、CoIP等初步结果
2️⃣信号通路解析：捕获激酶、受体与下游效应分子互作
3️⃣药物筛选：评估小分子化合物对蛋白互作的干扰
4️⃣核酸结合蛋白研究：分析蛋白与DNA/RNA的相互作用
5️⃣功能域鉴定：通过截断体确定互作关键区域
六、代表性实验结果
1
细胞样品＞2×107；动物组织＞100mg（黄豆粒大小）；植物组织＞5g
2
目标蛋白名称、分子量及互作假设；检测方法要求（银染/WB/质谱）